DNA 甲基化與癌癥

癌癥中 DNA 甲基化的改變已經(jīng)被認(rèn)為是開發(fā)強(qiáng)大的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)疾病發(fā)生生物標(biāo)志物較有潛力目標(biāo)。盡管有超過(guò) 14000 份文章中描述了基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)記物及其在癌癥中的臨床聯(lián)系，但只有 14 種生物標(biāo)記物被轉(zhuǎn)化為商業(yè)化的臨床測(cè)試。方法上和實(shí)驗(yàn)上的障礙都是造成這種巨大差異的主要原因，但是基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)記的基因組位置是一個(gè)內(nèi)在的和必要的屬性，它也有一個(gè)重要的和經(jīng)常被忽視的作用。作者檢查了 DNA 甲基化的位置對(duì)癌癥生物標(biāo)記物的發(fā)展的重要性，并通過(guò)商業(yè)上可獲得的測(cè)試，詳細(xì)研究了各種生物標(biāo)記物的基因組位置和其他相關(guān)特征。作者還強(qiáng)調(diào)了公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) DNA 甲基化發(fā)展的價(jià)值。

DNA 甲基化生物標(biāo)志物

在 2003 年，Peter Laird 表達(dá)了他對(duì) DNA 甲基化生物標(biāo)志物的信心，他相信近期人們對(duì) DNA 甲基化在人類癌癥中作用的理解所取得的進(jìn)展，有一天會(huì)產(chǎn)生大量強(qiáng)有力的以 DNA 甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物，特別是用于癌癥診斷。這種信念是基于大量的 DNA 甲基化的變化特征，使他們有成為生物標(biāo)志物的前途：這些變化頻繁地發(fā)生在癌癥早期，容易被現(xiàn)有技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在固定的樣本中有穩(wěn)定性，各種體液和細(xì)胞類型特異性樣本中均存在。DNA 甲基化作為腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)被大量發(fā)表。為了更準(zhǔn)確地定義這個(gè)數(shù)字，作者在 PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索描述 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物的出版物。根據(jù)對(duì)這些出版物中有代表性的子集進(jìn)行人工整理，共檢索到 14,743 篇研究文章，估計(jì)有 1,800 個(gè)標(biāo)志物。然而，只有 14 個(gè)以 DNA 甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物目前已在市場(chǎng)上出售，共涉及 13 個(gè)基因：

1、Glutathione S- transferase P (GSTP1); 

2、Adenomatous polyposis coli protein (APC); 

3、Ras association domain- containingprotein 1 (RASSF1); 

4、N- myc downregulated gene 4 (NDRG4); 

5、Bone morphogenetic protein 3 (BMP3); 

6、Septin-9 (SEPT9); 

7、Short stature homeobox protein 2 (SHOX2); 

8、Twist related protein 1 (TWIST1); 

9、Homeobox protein OTX1 (OTX1); 

10、One cut domain family member 2 (ONECUT2); 

11、Methylated-DNA-protein- cysteine methyltransferase (MGMT); 

12、Branched- chain-amino- acid aminotransferase, cytosolic (BCAT1); 

13、DNA- binding protein Ikaros (IKZF1)。

這 14 種生物標(biāo)志物，只有 9 種（GSTP1，APC、RASSF1、NDRG4、BMP3、兩個(gè) SEPT9  生物標(biāo)志物、SHOX2 和 MGMT) 已被納入一個(gè)或多個(gè)臨床指南。此外，只有兩項(xiàng)測(cè)試獲得了 FDA 的批準(zhǔn)：結(jié)腸衛(wèi)士（NDRG4 和 BMP3) 用于分析糞便樣本 DNA 和 Epi proColon (SEPT9) 用于便潛血的檢測(cè)。甲基化標(biāo)志物轉(zhuǎn)化的成功率也就 0.8%。

DNA 甲基化標(biāo)志物的臨床轉(zhuǎn)化

上述的轉(zhuǎn)化成功率以及目前公眾對(duì)科學(xué)研究的可靠性和效率的討論，都值得作者反思，為什么很少有 DNA 甲基化的生物標(biāo)記從發(fā)現(xiàn)和發(fā)表過(guò)渡到臨床試驗(yàn)。這個(gè)問(wèn)題的答案是復(fù)雜的、多方面的，主要與小樣本測(cè)試和缺乏實(shí)質(zhì)性的臨床價(jià)值，以及各種方法的說(shuō)明（如有偏差的病人選擇、研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析不當(dāng)，缺乏驗(yàn)證和 / 或不恰當(dāng)?shù)膱?bào)告），這些妨礙了徹底評(píng)估生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值。此外，開發(fā)定量分析特定生物標(biāo)志物（包括提供驗(yàn)證和探索臨床應(yīng)用的試驗(yàn)）所需的資金投入是一個(gè)主要障礙。這些問(wèn)題并不是基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物所特有的。生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域的研究人員普遍面臨著類似的問(wèn)題，盡管這些問(wèn)題直到現(xiàn)在才開始得到解決。

除了圍繞臨床轉(zhuǎn)化已有的問(wèn)題，作者相信在癌癥患者 DNA 甲基化生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用之間存在另一個(gè)經(jīng)常被忽視的障礙。在 2011 年的時(shí)候，作者就發(fā)文強(qiáng)調(diào)過(guò)甲基化所在基因組位置對(duì)于生物標(biāo)志物應(yīng)用的重要性。作者認(rèn)為，更好地理解和更詳細(xì)地分析 DNA 甲基化的基因組位置的臨床相關(guān)性，可以增加成功被轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)志物的數(shù)量。從這個(gè)角度來(lái)看，目前公開的表觀基因組數(shù)據(jù)為更好地選擇基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物的位置提供了機(jī)會(huì)。

位置的重要性

傳統(tǒng)上，DNA 甲基化研究和基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物研究主要集中于腫瘤抑制基因啟動(dòng)子 CpG 島的高甲基化效應(yīng)。然而，即使在單個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，并非所有 CpG 島在功能上都是相同的。例如，轉(zhuǎn)錄沉默通常是由啟動(dòng)子的一個(gè)或多個(gè)小部分的甲基化控制的，而不是由整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域控制的。因此，識(shí)別臨床相關(guān) CpG 島的準(zhǔn)確定位是發(fā)展 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物研究的重要一步。

應(yīng)用于診斷的甲基化標(biāo)志物

在一些研究中，GSTP1 的甲基化已被報(bào)道為一種很有前途的肝細(xì)胞癌（HCC) 診斷標(biāo)志物，但特異性水平差異很大。這種差異被假設(shè)為是由于檢測(cè)同一啟動(dòng)子的不同特定部分的造成的。研究人員采用亞硫酸氫鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn)，GSTP1 啟動(dòng)子的 5?區(qū)域區(qū)分肝細(xì)胞癌和非惡性肝細(xì)胞癌肝臟疾病或沒(méi)有確定的病理改變的肝臟組織特異性更強(qiáng)比 3?啟動(dòng)子（分別為 97.1% 和 60%; P <0.001)。同一研究團(tuán)隊(duì)，在研究 RASSF1 的甲基化作為 HCC 早篩標(biāo)志物時(shí)得出類似的結(jié)論（特異性依次為 72.9%，27.1% 和 38.6%，敏感性為固定的 90%；p<0.0001）。

預(yù)后甲基化標(biāo)記

在之前的研究中，作者分析了 GREM1 啟動(dòng)子 CpG 島內(nèi)的三個(gè)不同的基因組區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域中，只有一個(gè)區(qū)域的 CpGs 甲基化與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（RCC) 患者的不良預(yù)后相關(guān)；風(fēng)險(xiǎn)比（HR) 2.32, 95% CI 1.52-3.53;P = 0.001)。胃癌患者也觀察到類似的結(jié)果，MAL 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與胃癌的預(yù)后相關(guān)，并下調(diào)基因表達(dá)，該特定的啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS)。研究人員描述了位于 CpG 島外的 NMDAR2B 基因啟動(dòng)子的一個(gè)小區(qū)域的甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌患者和疾病特異性生存結(jié)果之間的關(guān)系（HR 3.13, 95%) 可信區(qū)間 1.05 - -9.72;P≤0.006)，而 DNA 甲基化在另外兩個(gè)位置，位于 TSS 下游和內(nèi)側(cè) CpG 島與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。

有趣的是，單個(gè) CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)，而不是包含多個(gè) CpG 二核苷酸更廣泛區(qū)域的甲基化狀態(tài)已經(jīng)被證明會(huì)影響基因表達(dá)的調(diào)控。在 CLL 中，ZAP70 基因經(jīng)過(guò)高分辨率的甲基化掃描后發(fā)現(xiàn)，一個(gè)單 CpG 位點(diǎn)（TSS 下游 233bp 處）的甲基化狀態(tài)與病人的預(yù)后顯著相關(guān)。

早篩的甲基化標(biāo)志物

在描述 MGMT 甲基化對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)測(cè)力的研究中，MGMT 的甲基化狀態(tài)是通過(guò)甲基化特異性來(lái)評(píng)估的 PCR (MSP)，使用引物僅覆蓋 MGMT 基因的外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域的少量 CpG 二核苷酸。甲基化與 MGMT 表達(dá)和 / 或活性之間的直接相關(guān)性未被研究。在這一發(fā)現(xiàn)之后，許多 25 - 27 歲的研究者使用諸如焦磷酸測(cè)序等定量技術(shù)對(duì) MGMT 基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了更詳細(xì)的分析。這些研究的目的是為了對(duì)特定的甲基化模式有更深入的了解，以確定 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中是重要的 CpG 二核苷酸，并確定臨床價(jià)值的甲基化變化區(qū)域。已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于與 MGMT 表達(dá)相關(guān)的特定甲基化區(qū)域，甚至單個(gè) CpG 二核苷酸的結(jié)果是相互矛盾的。商業(yè)化的 PredictMDx 產(chǎn)品測(cè)試所覆蓋含的 CpGs 75-78 區(qū)域是目前研究建議的區(qū)域，該區(qū)域的 CpG 二核苷酸甲基化已被反復(fù)證明與有利的患者預(yù)后相關(guān)。

基因組結(jié)構(gòu)

特定 CpG 二核苷酸在單個(gè)基因組區(qū)域的甲基化，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，也可以決定生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值。因此，確定一個(gè)潛在的相關(guān)的基因組位置對(duì)以 DNA 甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)志物很重要。除了位置之外，DNA 甲基化的基因組背景也必須考慮，例如，不同功能區(qū)域的存在，如外顯子或增強(qiáng)子。這些不同區(qū)域的存在與甲基化特征有關(guān)。啟動(dòng)子區(qū)  CpG 島往往是低甲基化的，而基因 body 區(qū)，特別是外顯子區(qū)往往是甲基化的。2012 年發(fā)表的研究表明，在發(fā)育和疾病過(guò)程中，基因間區(qū)和基因內(nèi)區(qū) DNA 甲基化的改變都受到調(diào)節(jié)，這些改變積極參與了轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。非啟動(dòng)子位點(diǎn)的甲基化在幾個(gè)重要過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮作用，包括剪接、來(lái)自替代啟動(dòng)子的替代轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)和增強(qiáng)子激活，盡管這種 DNA 修飾仍然是生物標(biāo)志物開發(fā)的一個(gè)很大程度上未被探索的領(lǐng)域。然而，潛在的臨床應(yīng)用已經(jīng)證明甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)志物在某些非啟動(dòng)子位置。例如，對(duì)于 15q25 染色體區(qū)域的多個(gè)鄰近基因的長(zhǎng)期表觀遺傳沉默（LRES) 呈陽(yáng)性的胃癌患者，其疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較低（HR 0.6;95% 可信區(qū)間 0.38 - -0.94;P = 0.027)。異常增強(qiáng)子高甲基化也被證明是預(yù)后的患者生存 RCC (log- rank P < 0.05)。隨著作者對(duì)這些類型的 DNA 甲基化模式的生物學(xué)和效應(yīng)的理解進(jìn)步，作者將毫無(wú)疑問(wèn)地看到，啟動(dòng)子區(qū)域之外的甲基化生物標(biāo)志物數(shù)量將會(huì)增加。

生物標(biāo)志物的發(fā)展

為了使特定基因組位置的甲基化成為一個(gè)良好的生物標(biāo)志物，必須在臨床檢測(cè)出感興趣的組之間甲基化的顯著差異：

例如，作為診斷生物標(biāo)志物區(qū)分腫瘤和非腫瘤組織； 預(yù)后標(biāo)記區(qū)分高危疾病患者和低危疾病患者； 或者預(yù)測(cè)標(biāo)記區(qū)分有反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者之間。理想情況下，相關(guān)基因在兩組之間應(yīng)該有差異表達(dá)。候選診斷生物標(biāo)志物的一個(gè)經(jīng)典例子是腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的高甲基化。甲基化和基因表達(dá)之間的聯(lián)系提供了一個(gè)清晰的生物學(xué)原理，但基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)記不一定與基因表達(dá)的可測(cè)量變化相關(guān)聯(lián)。例如，在商業(yè)化的生物標(biāo)志物中，有 4 個(gè)（APC、RASSF1 和 SEPT9 兩個(gè)生物標(biāo)志物）沒(méi)有顯示 DNA 甲基化和相關(guān)基因表達(dá)之間的相關(guān)性。

結(jié)論

十多年前，以 DNA 甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物被認(rèn)為是癌癥生物標(biāo)記物研究的下一個(gè)“大事件”，但到目前為止，它們一直難以達(dá)到預(yù)期。對(duì)于為什么如此之少以 DNA 甲基化為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物商業(yè)化，有幾種可能的解釋，但作者認(rèn)為 DNA 甲基化與其高精度的基因組位置之間的復(fù)雜關(guān)系是主要障礙之一。為了減少已發(fā)表的生物標(biāo)志物數(shù)量和臨床使用的生物標(biāo)志物數(shù)量之間的差異，作者制定了三個(gè)簡(jiǎn)單的建議來(lái)開發(fā)基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物。根據(jù)這些建議開發(fā)的生物標(biāo)志物并不能保證是可重復(fù)的或臨床相關(guān)的，但是，至少 DNA 甲基化的生物標(biāo)志物障礙，確定臨床相關(guān)的區(qū)域，可以通過(guò)分析公開可用的數(shù)據(jù)來(lái)克服。為了系統(tǒng)地評(píng)估基于 DNA 甲基化的生物標(biāo)記物的表現(xiàn)，并支持未來(lái)對(duì)此類生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的準(zhǔn)確報(bào)告，作者正在開發(fā)一個(gè)包含所有已發(fā)表生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)庫(kù)，以及一個(gè)生物標(biāo)記物的報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。作者希望這些建議和持續(xù)的努力將有助于提高基于 DNA 甲基化的標(biāo)記的性能，促進(jìn)可重復(fù)性，并減少目前在這一領(lǐng)域產(chǎn)生的研究浪費(fèi)。

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