1、新鮮組織樣本包埋

目前新鮮組織的包埋方法有兩種，一種是液氮 + 異戊烷法；另一種的干冰法。對(duì)于臨床手術(shù)切下來的組織樣本一般使用干冰的包埋方法。對(duì)于穿刺樣本等一些較小，較輕的樣本，一般推薦用液氮 + 異戊烷的方法進(jìn)行冷凍。OCT 包埋組織塊可以在–80oC 的密封容器中長(zhǎng)期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片。

2、冷凍切片切、組織樣本質(zhì)控及貼片

由于空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)的是組織中的 RNA，因此要對(duì)切片中的 RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。我們一般取 10 片組織切片進(jìn)行 RNA 抽提并質(zhì)檢，確定組織中 RNA 完整性（RIN>7）。所以要求我們的組織樣本要保證可以切到至少 20 片 10um 厚度的切片，以便完成所有的實(shí)驗(yàn)。

3、組織優(yōu)化

組織優(yōu)化的目的是摸索樣本的透化條件，保證組織切片中的 mRNA 能夠充分釋放。該步驟是獲取真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的必要條件。否則，我們無法判斷是基因表達(dá)高低到底是因?yàn)橥富怀浞謱?dǎo)致的，還是實(shí)際就是這個(gè)樣子。因此：每個(gè)樣本建議都要做透化，尤其是臨床樣本。

4、成像

應(yīng)使用 Visium Imaging Test Slide 驗(yàn)證成像設(shè)置。明場(chǎng)成像基準(zhǔn)框和基準(zhǔn)標(biāo)記應(yīng)清晰可見，并使用 Brightfeld 設(shè)置聚焦。Visium Imaging Test Slide 四個(gè)區(qū)域（A1，B2，C1，D2）具有熒光斑點(diǎn)，可通過 TRITC 和 Cy5 flter cubes 檢測(cè)到，熒光設(shè)置應(yīng)清晰可見 A1，B2，C1 和 D2 中的熒光點(diǎn)，且熒光點(diǎn)信號(hào)應(yīng)從左到右減小。

5、正式實(shí)驗(yàn)

正式實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 長(zhǎng)度分布，濃度和量進(jìn)行判斷。cDNA 的長(zhǎng)度分布在~200bp-9000bp 之間，在 1000bp 左右會(huì)有峰值（不同的組織類型會(huì)有些許差異）。

6、測(cè)序

在捕獲區(qū)域，每個(gè)組織覆蓋的 spot 建議至少測(cè) 50000 read pairs。整個(gè)捕獲區(qū)域共有 5000 個(gè) spots?？梢愿鶕?jù)組織貼到芯片上后，覆蓋芯片的大小來判斷測(cè)序的數(shù)據(jù)量。

計(jì)算公式（Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot 例如：組織覆蓋了 60% 的區(qū)域，則數(shù)據(jù)量為（0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。