抗 PD-(L)1 免疫檢查點(diǎn)抑制治療已成為晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的一線治療方案。對(duì)于早期可切除 NSCLC，近年來新輔助免疫治療的方案顯示出良好的治療前景。然而，仍然只有約 40% 的早期 NSCLC 在新輔助免疫治療后達(dá)到主要病理緩解（major pathologic response，MPR），大部分患者依舊對(duì)治療抵抗【1】。腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）對(duì)于腫瘤治療耐藥有重要作用，而治療本身又可重塑 TME。解析免疫治療和 TME 的相互作用可能是解決 NSCLC 免疫治療抵抗的關(guān)鍵突破口。盡管免疫治療在晚期 NSCLC 已實(shí)踐多年，但是關(guān)于免疫治療對(duì)肺癌 TME 作用的研究仍然很缺乏。
近日， 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬課題組與同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王晨飛課題組與合作，于 Genome Medicine 雜志在線發(fā)表題為 Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing 的研究論文 。 該研究利用單細(xì)胞及大量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學(xué)以及多色熒光染色系統(tǒng)刻畫 NSCLC 的 TME 在新輔助免疫治療中的動(dòng)態(tài)變化，鑒定出新的生物標(biāo)志物以及潛在的耐藥的新機(jī)制。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序由伯豪生物提供服務(wù)
在該研究中，作者收集了 15 例 IIIA 期 NSCLC 新輔助免疫治療前后的原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序，這些樣本被分為治療前（treatment-na?ve，TN），治療后病理緩解組（MPR）以及非病理緩解組（NMPR）三組。此外作者還對(duì)另外 21 例新輔助免疫治療基線期的原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行 bulk 轉(zhuǎn)錄組測序，作為獨(dú)立的驗(yàn)證隊(duì)列 （圖一）。質(zhì)控后總共獲得 92330 個(gè)單細(xì)胞，聚類后分為上皮細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、髓系細(xì)胞等。作者首先探索了腫瘤細(xì)胞在治療前后轉(zhuǎn)錄特征。通過三個(gè)組間的對(duì)比，發(fā)現(xiàn) MPR 組的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出免疫激活的特征（高表達(dá)免疫細(xì)胞趨化因子 CX3CL1 和 MHC-II 相關(guān)分子），而 NMPR 組則高表達(dá)雌激素代謝相關(guān)的基因（AKR1C1-3）以及富集雌激素相關(guān)的通路。進(jìn)一步作者通過非靶向代謝組證實(shí) NMPR 患者在治療過程中會(huì)出現(xiàn)血漿雌激素水平升高。
圖 1 研究樣本組成
接著研究人員進(jìn)一步分析各個(gè)免疫細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)比 TN 組，MPR 和 NMPR 組的 CD8+ T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞均被激活，但是 MPR 組的殺傷性 CD8+ T 細(xì)胞和 CD16+ NK 細(xì)胞更多，且 Treg 更少。在 CD20+ B 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達(dá) CD86 的 FCRL4+FCRL5+ 非經(jīng)典記憶 B 細(xì)胞亞群 【2】 富集在 MPR 患者中。進(jìn)一步通過多色熒光染色發(fā)現(xiàn)這群 B 細(xì)胞位于三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨(dú)立的驗(yàn)證隊(duì)列中，MPR 患者基線期的這群 FCRL4+FCRL5+ B 細(xì)胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個(gè)黑色素瘤隊(duì)列中也發(fā)現(xiàn)這群 B 細(xì)胞在反應(yīng)者的富集程度高于無反應(yīng)者。細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)這群 B 細(xì)胞可以通過 CD86-CD28 和 CD40-CDLG 激活濾泡輔助 T 細(xì)胞（follicular helper T，Tfh）產(chǎn)生 IL21，而 IL21 可進(jìn)一步激活 CD8+ T 細(xì)胞 【3】。
通過分析髓系細(xì)胞的異質(zhì)性，作者發(fā)現(xiàn) CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細(xì)胞 [4] 在 MPR 患者中富集，可能通過分泌 CFP 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其信號(hào)的富集同樣可預(yù)測好的免疫治療效果 （圖 4）。由于采用 BD 單細(xì)胞測序平臺(tái)，作者獲得了較多的中性粒細(xì)胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個(gè)亞群，其中一群 CCL3+ 的衰老中性粒細(xì)胞在 MPR 中明顯減少且在 NMPR 組中增加，而這群衰老的中性粒高表達(dá) PD-L1 和 IDO1 等免疫檢查點(diǎn)且趨化因子 IL8。通過細(xì)胞互作分析，作者發(fā)現(xiàn) CCL3+ 的衰老中心?？赡芎?SPP1+ 巨噬細(xì)胞存在著正反饋調(diào)節(jié)以互相促進(jìn)增加：SPP1+ 巨噬細(xì)胞分泌 SPP1 誘導(dǎo)中性粒向衰老 CCL3+ 表型轉(zhuǎn)化，而這群中性粒則分泌 CCL3、CCL4 等趨化因子反過來招募更多的 SPP1+ 巨噬細(xì)胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細(xì)胞測序系統(tǒng)刻畫了免疫治療過程 TME 的變化，為后續(xù)肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數(shù)據(jù)支持。 作者對(duì)比 MPR 和 NMPR 的 TME 差異，提出 FCRL4+FCRL5+ B 細(xì)胞、CD16+CX3CR1+ 單核細(xì)胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標(biāo)志物，并在獨(dú)立和公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗(yàn)證。結(jié)合 BD 平臺(tái)捕獲單細(xì)胞的優(yōu)勢，系統(tǒng)分析了免疫過程中中性粒細(xì)胞和治療應(yīng)答之間的關(guān)系。
同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院 張鵬 教授和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 王晨飛 研究員為該論文共同通訊作者，同濟(jì)大學(xué)博士生 胡俊杰、嚴(yán)以律、 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院助理研究員張樂樂和南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻(xiàn)：
1. Forde PM, Spicer J, Lu S, Provencio M, Mitsudomi T, Awad MM, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer. N Engl J Med. 2022; 386:1973-1985.
2. Li H, Dement-Brown J, Liao PJ, Mazo I, Mills F, Kraus Z, et al. Fc receptor-like 4 and 5 define human atypical memory B cells. Int Immunol. 2020; 32:755-770.
3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
