期刊：CELL

影響因子：66.85

技術(shù)服務(wù)：scRNA-seq

導(dǎo)   讀

盡管以 T 細(xì)胞為中心的免疫療法已經(jīng)取得了無可爭(zhēng)議的臨床成功，但數(shù)量有限的獲得持久響應(yīng)的患者迫切需要補(bǔ)充的治療策略。NK 細(xì)胞，作為腫瘤微環(huán)境中一類重要的組成部分參與腫瘤控制的多個(gè)過程，如直接的殺傷細(xì)胞和分泌促炎因子等。利用 NK 細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療已提出了大量的策略，其特點(diǎn)是有希望的特性，包括其安全性和有效性。特別值得注意的是，嵌合抗原受體（CAR)- NK 細(xì)胞治療淋巴瘤、骨髓瘤和白血病取得了顯著的臨床成功。然而，基于 NK 細(xì)胞的治療在實(shí)體瘤中受到阻礙，部分原因是對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性 NK 細(xì)胞的了解不完全，特別是它們對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、表型異質(zhì)性和 TME 內(nèi)的失調(diào)。

人體中的 NK 細(xì)胞可被劃分為 2 種主要的類，CD56dimCD16hi 和 CD56brightCD16lo，主要基于 CD56 (NCAM1) 和 CD16 (FCGR3A) 的表達(dá)水平。CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞群主要通過分泌穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)靶細(xì)胞的殺傷，而 CD56brightCD16lo NK 細(xì)胞群表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。近期，單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞異質(zhì)性的表征，為闡明腫瘤浸潤(rùn) NK 細(xì)胞亞群的圖譜提供了很大機(jī)會(huì)。例如，我們鑒定了 CD160+HSPA1A+ 肝常駐細(xì)胞亞型在肝細(xì)胞癌中的特異性富集，其他人則報(bào)道了出現(xiàn)在黑色素瘤中浸潤(rùn)的特異的 NK 細(xì)胞亞群具有區(qū)域性差異。同時(shí)，人類 NK 細(xì)胞在在健康組織和血液中的分布和功能也得到了研究。然而，對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)的 NK 細(xì)胞，大多數(shù)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序的規(guī)模是有限的，并且它們?cè)趷盒约膊≈蝎@得的異質(zhì)性表型的程度仍不清楚。

與 CD8+ T 細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞作為細(xì)胞毒性活性的替代來源，以低突變負(fù)荷和主要組織相容性復(fù)合體（MHC) I 類異常表達(dá)來對(duì)抗腫瘤細(xì)胞。盡管 CD8+ T 細(xì)胞的功能失調(diào)狀態(tài)以細(xì)胞毒性降低和多種抑制受體的高表達(dá)為特征，但 NK 細(xì)胞功能失調(diào)尚未得到詳細(xì)研究。此前，肝癌中有 NK 細(xì)胞功能低下的報(bào)道，但尚未分析其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其他癌癥類型是否也存在這種現(xiàn)象尚不清楚。此外，盡管 TIGIT 和 TIM3 在腫瘤浸潤(rùn)性 NK 細(xì)胞中的抑制作用已經(jīng)明確，但其他免疫檢查點(diǎn)如 PD- 1 和 CTLA4 是否在這些細(xì)胞中發(fā)揮同樣的作用甚至表達(dá)仍然存在爭(zhēng)議。此外，NK 細(xì)胞對(duì) TME 的免疫抑制因子敏感，這可能導(dǎo)致它們的功能失調(diào)的表型，但不同的調(diào)節(jié)過程如何影響不同癌癥類型的 TME 中 NK 細(xì)胞的功能和豐度尚不清楚?？傊@些促使我們對(duì) NK 細(xì)胞進(jìn)行深入研究，以闡明它們?cè)诜喊┌Y水平上的異質(zhì)性和功能障礙。

在這里，我們收集了廣泛的已發(fā)表和新生成的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)全面的腫瘤浸潤(rùn)人類 NK 細(xì)胞圖譜，并探索了 NK 細(xì)胞在不同癌癥類型和組織中的異質(zhì)性。我們揭示了腫瘤浸潤(rùn) NK 細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，并強(qiáng)調(diào)了可能導(dǎo)致 NK 細(xì)胞功能障礙的 TME 成分。這些數(shù)據(jù)將為促進(jìn)對(duì)主要癌癥類型中 NK 細(xì)胞的整體特性的理解提供豐富的資源，并為基于 NK 細(xì)胞的免疫治療的發(fā)展提供有價(jià)值的見解。

1. 在單細(xì)胞分辨率水平下構(gòu)建人類泛癌 NK 細(xì)胞圖譜

為腫瘤浸潤(rùn) NK 細(xì)胞構(gòu)建一個(gè)綜合的泛癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，我們首先從我們新生成的數(shù)據(jù)集中收集了 47 名診斷為 8 種癌癥類型之一的患者的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)和 70 個(gè)其他已發(fā)表的數(shù)據(jù)集。這些數(shù)據(jù)覆蓋了 24 種癌癥類型，包括來自 716 個(gè)病人的 1223 個(gè)樣本，包括腫瘤、臨近非腫瘤組織、外周血、和其他組織如淋巴結(jié)，以及 60 名健康對(duì)照樣本（圖 1A-B)。經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控和計(jì)算門控（CD3CD56+/KLRF1+) 及非監(jiān)督聚類結(jié)合的方法，本研究中我們獲得了 160011 個(gè)高質(zhì)量的 NK 細(xì)胞，包含 11963 個(gè)新生成的 NK 細(xì)胞。值得注意的是，考慮到腫瘤組織內(nèi) NK 細(xì)胞在 CD45+ 細(xì)胞中相對(duì)較少，對(duì)它們的異質(zhì)性了解的較少，因此，構(gòu)建如此大規(guī)模的 NK 細(xì)胞圖譜是必不可少且有挑戰(zhàn)性的。與先前的來自人血液和脾臟的 7000 個(gè) NK 細(xì)胞構(gòu)建的 NK 細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜相比，我們的規(guī)模擴(kuò)大了 20 倍，代表了大多數(shù)主要的癌癥類型和多種組織。

為了無偏的定義 NK 細(xì)胞的泛癌群體結(jié)構(gòu)，我們整合了數(shù)據(jù)集之間最小批次效應(yīng)的單細(xì)胞 RNA 數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了 2 輪無監(jiān)督聚類。第一輪分析涉及區(qū)分兩種特征明確的主要細(xì)胞類型，CD56brightCD16lo  和 CD56dimCD16hi，主要基于高表達(dá)的典型細(xì)胞標(biāo)記 NCAM1 和 FCGR3A，分別對(duì)應(yīng)于先前報(bào)道的“NK_1”和“NK_2”群體。CD56brightCD16lo 區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為 5 個(gè)子集，而 CD56dimCD16hi 區(qū)在第二輪聚類中被識(shí)別出 9 個(gè)子集（圖 1C-D)。我們沒有觀察到兩種主要大群在不同癌癥類型或不同亞群中 KLRF1 的表達(dá)有顯著差異。值得注意的是，之前報(bào)道的 ILC 細(xì)胞標(biāo)記基因幾乎不在這些 NK 細(xì)胞亞群中表達(dá)，表明了我們數(shù)據(jù)的純度。這些亞群的特點(diǎn)是在每個(gè)主要群體中都有不同的特征基因的高表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，先前描述的亞群很容易在我們的圖譜中被識(shí)別出來，例如 CD56brightCD16lo c5-CREM 亞群伴隨著 CREM 高表達(dá)。伴隨著 KLRC2 (NKG2C) 的高表達(dá)的 CD56dimCD16hi c8-KLRC2 NK 細(xì)胞亞群被視為適應(yīng)性的 NK 細(xì)胞。我們的圖譜還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)被低估的 NK 細(xì)胞亞群，它們具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄表型。例如，CD56dimCD16hi c5-MKI67 以 MKI67 和 STMN1 等增殖標(biāo)志物的高表達(dá)為特征，CD56dimCD16hi c6-DNAJB1 特異性表達(dá)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因。我們的圖譜還在幾乎所有癌癥類型中捕獲了低比例的 CD56brightCD16hi NK 細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)高水平的 NCAM1 和 FCGR3A。CD56brightCD16hi NK 細(xì)胞表現(xiàn)出介于 CD56brightCD16lo 和 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞之間的中間特征，可能代表了類似于小鼠 CD27+CD11b+ NK 細(xì)胞的發(fā)育中間體，這也被認(rèn)為是小鼠的短暫成熟階段，但 scRNA-seq 幾乎無法檢測(cè)到。接下來，我們檢查了所有亞群的組織分布，觀察到不同的組織富集模式，表明我們的綜合分析可以保留不同組織的異質(zhì)性 (圖 1E-F)。為了進(jìn)一步證實(shí)聚類的穩(wěn)定性，我們將血液、腫瘤和鄰近非腫瘤組織中的 NK 細(xì)胞分別重新聚類，結(jié)果顯示高度一致。最后，利用可以測(cè)量細(xì)胞簇純度的全局未移位熵比（ROGUE) 指數(shù)，表明所有這些群體在各種癌癥類型中都是穩(wěn)健的。

NK 細(xì)胞亞群參與了不同的發(fā)育階段，其共同譜系特異性基因的表達(dá)揭示了這一點(diǎn)。腫瘤中富集的 CD56bright CD16lo c4-IL-7R 和血液中富集的 c2-IL-7R-RGS1lo 細(xì)胞，高表達(dá) NK 細(xì)胞前體標(biāo)志物，都是在發(fā)育早期繪制的。相比之下，其他未成熟的 CD56brightCD16lo 亞群表現(xiàn)出前體標(biāo)志物的逐漸減少和 CD160 表達(dá)的大量增加。更成熟的 CD56dimCD16hi 亞群，特別是 c6-DNAJB1 和 c7- NR4A3，除了 FCGR3A 和 B3GAT1 (CD57) 外，還表現(xiàn)出殺傷免疫球蛋白樣受體（KIR) 家族的上調(diào)。不同發(fā)育狀態(tài)的 NK 細(xì)胞亞群在腫瘤中同時(shí)存在，表明 NK 細(xì)胞向腫瘤的遷移可能與 NK 細(xì)胞成熟解耦有關(guān)。

我們進(jìn)一步檢查了基因表達(dá)特征，以破譯不同群體之間的功能差異（圖 1G)。CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞毒效應(yīng)基因，包括穿孔素（PRF1) 和除 GZMK 外的大多數(shù)顆粒酶（GZMB、GZMA 和 GZMH)，而 GZMK 只在 CD56brightCD16lo NK 細(xì)胞中表達(dá)。CD56brightCD16lo NK 細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子基因，如 IL18。我們還觀察到 CD56brightCD16lo c2 和 c4 同時(shí)表達(dá) il -18 及其受體 IL18R1，這意味著 il -18 依賴性自分泌途徑在這些亞群中可能起著至關(guān)重要的作用。引人注目的是，CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞亞群也可以表現(xiàn)出某些細(xì)胞因子的特異性表達(dá)，但與 CD56brightCD16lo 亞群具有不同的模式。特別是，CD56dim CD16hi 亞群 c4-NFKBIA 在所有 NK 細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出相對(duì)較高的炎癥評(píng)分，主要表達(dá) CCL3、CCL4 和 CCL4L2，表明它們有能力招募其他免疫細(xì)胞，如 T 細(xì)胞。最近的研究將 1 型常規(guī)樹突狀細(xì)胞（cDC1s) 募集到腫瘤與 NK 細(xì)胞聯(lián)系起來，通過 NK 細(xì)胞分泌 XCL1、XCL2 和 CCL5 來實(shí)現(xiàn)。我們的研究鑒定出了通過細(xì)胞類型特異性互補(bǔ)策略參與 cDC1 募集的多種 NK 細(xì)胞亞群。CD56brightCD16lo c2 和 c4 表達(dá)初級(jí)水平的 XCL1 和 XCL2，而 CD56brightCD16lo (c1-GZMH 和 c3-CCL3) 和 CD56dimCD16hi (c1-IL-32 和 c8-KLRC2) NK 細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)另一個(gè) cDC1 趨化基因 CCL5。此外，我們描述了激活和抑制受體的概況，觀察到 NK 細(xì)胞亞群的明顯變化。例如，KLRC1 在 CD56brightCD16lo NK 細(xì)胞中的表達(dá)水平高于 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞，盡管不是特異性的，LAG3 和 TIGIT 在 c8-KLRC2 中高表達(dá)。值得注意的是，與其他組織富集的 CD56dimCD16hi 亞群（c4-NFKBIA, c5-MKI67 和 c7-NR4A3) 相比，c6-DNAJB1 NK 細(xì)胞表現(xiàn)出最高的應(yīng)激評(píng)分和最弱的細(xì)胞毒性，表明它們的轉(zhuǎn)錄和功能表型存在顯著差異（圖 1G)。綜上所述，我們以細(xì)粒度的亞群分辨率提供了 NK 細(xì)胞的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組譜。而不是分析 NK 細(xì)胞作為一個(gè)單一的群體，我們剖析 NK 細(xì)胞的亞群特異性分子特性，并揭示其未被重視的異質(zhì)性。

2. 不同腫瘤類型 NK 細(xì)胞的組織異質(zhì)性

接下來，我們?cè)u(píng)估了腫瘤浸潤(rùn) NK 細(xì)胞群在不同癌癥類型中的偏好，觀察到明顯的差異（Figure 2A)。例如，未成熟的 CD56brightCD16lo NK 細(xì)胞在鼻咽癌和基底細(xì)胞癌中占主導(dǎo)地位，而成熟的 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞在腎癌和肺癌中占主導(dǎo)地位，這與先前的報(bào)道一致。其他的，如結(jié)直腸癌和肝癌，沒有明顯的傾向（圖 2A)。為了檢驗(yàn)上述趨勢(shì)是否可以用器官結(jié)構(gòu)來解釋，我們分析了鄰近非腫瘤組織中主要 NK 細(xì)胞類型的內(nèi)在組成及其在腫瘤中的相應(yīng)變化。在某些類型的癌癥中，如結(jié)直腸癌，腫瘤組織的 NK 細(xì)胞組成與鄰近的非腫瘤組織相似。在肺癌、腎癌等腫瘤類型中，盡管腫瘤與鄰近非腫瘤組織中主要 NK 細(xì)胞類型保持不變，但 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞的比例明顯降低（圖 2B)。有趣的是，乳腺癌和食管癌腫瘤主要的 NK 細(xì)胞群與它們的鄰近非腫瘤組織相比是相反的（圖 2C)。這些觀察結(jié)果表明，內(nèi)部器官特性和惡性腫瘤相關(guān)因素對(duì)形成 NK 細(xì)胞群的成分有復(fù)合的影響。

我們進(jìn)一步從子集的角度探索 NK 細(xì)胞的癌癥類型特異性，并進(jìn)行無監(jiān)督聚類，根據(jù) NK 細(xì)胞亞群比例對(duì)所分析的癌癥類型進(jìn)行分層。NK 細(xì)胞亞群如 c2-CX3CR1 在胰腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好。在某些亞型的癌癥類型中觀察到高變異性。例如 c4-NFKBIA 和 c7-NR4A3 從頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和甲狀腺癌到食管癌和鼻咽癌的中位數(shù)頻率顯著降低（圖 2D)。盡管觀察到明顯的差異，但包括子宮內(nèi)膜癌、基底細(xì)胞癌和食管癌在內(nèi)的癌癥類型聚集在一起，均具有豐富的 CD56brightCD16hi c5-CREM 和較少的 c4-IL-7R NK 細(xì)胞。特別值得注意的是，具有上述低飽和度階段的罕見 CD56brightCD16hi NK 細(xì)胞亞群在黑色素瘤和白血病中大量存在，特別是在急性髓系白血?。ˋML) 亞型中（圖 2D)。NK 細(xì)胞的這種低飽和度階段與 AML 患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期的降低有關(guān)。與其他 NK 細(xì)胞群相比，這些 CD56brightCD16hi 細(xì)胞在其極低的激活和抑制受體評(píng)分方面表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能變化（圖 2E)。目前基于 NK 細(xì)胞的治療側(cè)重于增強(qiáng) NK 細(xì)胞的激活和壽命，但通常忽略了癌癥類型之間的異質(zhì)性和 TME 對(duì) NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性功能的抑制作用，這些都應(yīng)該在未來的治療策略中加以考慮。

3. RGS1 是組織浸潤(rùn) NK 細(xì)胞的標(biāo)志

如上所述，NK 細(xì)胞成分從血液到組織都發(fā)生了顯著變化。同樣，在組織浸潤(rùn) NK 細(xì)胞和它們的血液對(duì)應(yīng)物之間檢測(cè)到廣泛的轉(zhuǎn)錄變化（圖 3A-B)。先前的研究已經(jīng)確定了組織駐留 NK 細(xì)胞的幾種標(biāo)記物，如 CD69、CD103、CXCR6 和 CD49a。然而，我們發(fā)現(xiàn) ITGA1 (CD49a)、ITGAE (CD103) 和 CXCR6 在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平很少被檢測(cè)到，CD69 在 NK 細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包括血液來源的（圖 3E)。此外，有報(bào)道顯示，這些標(biāo)記物在特定組織的 NK 細(xì)胞群中優(yōu)先表達(dá)。這些促使我們以無偏的方式從泛癌的角度發(fā)現(xiàn)強(qiáng)大的 NK 細(xì)胞駐留標(biāo)記。

我們選擇了血液和組織之間的差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步評(píng)估了它們的敏感性和特異性，以區(qū)分 NK 細(xì)胞的組織來源。因此，RGS1 (G 蛋白信號(hào) 1 的調(diào)節(jié)因子）被明確識(shí)別，它只在腫瘤和鄰近非腫瘤組織的 NK 細(xì)胞中表達(dá)，而在血液中幾乎檢測(cè)不到（圖 3C-D)。此外，RGS1 的表達(dá)與 KLF2、SELL 等遷移信號(hào)相反（圖 3E)。與上述常規(guī)組織駐留標(biāo)記相比，RGS1 具有更高的敏感性和特異性。接下來，我們直接比較了 RGS1 與 ITGAE、CD69 及其聯(lián)合在血液中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn) RGS1 單獨(dú)在血液中的檢出率最低，而 RGS1/CD69 聯(lián)合可以進(jìn)一步提高組織中的陽性檢出率（圖 3F)。此外，RGS1/CD69 聯(lián)合在區(qū)分血液和非血液 NK 細(xì)胞方面比單獨(dú)使用具有更高的曲線下面積（AUC) 值。值得注意的是，RGS1 在分析的患者和癌癥類型中廣泛表達(dá)（圖 3G-H)。

綜上所述，這些特征暗示了 RGS1 單獨(dú)或與 CD69 結(jié)合的潛在作用，在轉(zhuǎn)錄組水平上是組織浸潤(rùn) NK 細(xì)胞的優(yōu)良標(biāo)記物。我們推測(cè) RGS1 的表達(dá)可能減弱 G 蛋白的信號(hào)活性，導(dǎo)致 NK 細(xì)胞趨化遷移能力減弱，促進(jìn) NK 細(xì)胞駐留。RGS1 在 NK 細(xì)胞中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4. 腫瘤相關(guān) NK 細(xì)胞程序及其特征

接下來，我們?cè)噲D闡明 NK 細(xì)胞在腫瘤中的明確特征。除了上述某些亞群在腫瘤特異性富集外，我們發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤組織相比，在腫瘤中，CD56brightCD16lo c3-CCL3 NK 細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)量較低，表現(xiàn)為 CCL3 和 CCL4 的表達(dá)減少，并且在大多數(shù)癌癥類型中，c5-CREM NK 細(xì)胞中 XCL1 和 XCL2 的表達(dá)減少，暗示它們?cè)谀[瘤中的功能轉(zhuǎn)換。然后，我們使用 SCENIC 識(shí)別了腫瘤浸潤(rùn)性 CD56brightCD16lo 和 CD56dim CD16hi NK 細(xì)胞亞群的激活調(diào)控子。重要的是，腫瘤富集的 c6-DNAJB1 亞群表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄因子如 KLF6 和 EGR3 的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞毒性功能的抑制有關(guān)。

利用 RNA 速率，我們解碼了 NK 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，在 CD56brightCD16lo 和 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞中觀察到從血液富集的亞群到腫瘤浸潤(rùn)群的明確定向流動(dòng)（圖 4A)。相應(yīng)的，RGS1 的表達(dá)沿流速方向升高。我們發(fā)現(xiàn) CD56dimCD16hi c6-DNAJB1 NK 細(xì)胞位于速率末端，從而推斷為終末狀態(tài)（圖 4A)。值得注意的是，來自鄰近非腫瘤組織的 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞主要觀察到在 UMPA 圖上富含 c7-NR4A3 細(xì)胞；相比之下，腫瘤來源的 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞在富含 c6-DNAJB1 細(xì)胞的 UMAP 圖上占優(yōu)勢(shì)地位（圖 4B)。與此一致的是，腫瘤富集的 c6- DNAJB1 NK 細(xì)胞的標(biāo)記物，如 DNAJB1 和 HSPA1A 在腫瘤浸潤(rùn)的 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞群中高度表達(dá)（圖 4C)。此外，我們觀察到 c6-DNAJB1 和 c7-NR4A3 NK 細(xì)胞中線粒體基因的表達(dá)水平相似，表明 c6-DNAJB1 NK 細(xì)胞的應(yīng)激表型與細(xì)胞質(zhì)量無關(guān)。由于 c6-DNAJB1 細(xì)胞在腫瘤中特異性富集，我們將這一群體稱為腫瘤相關(guān) NK (TaNK) 細(xì)胞。

多重免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤中 TaNK 細(xì)胞的存在（圖 4D)。我們還利用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了 TaNK 細(xì)胞（CD56dimCD16hi HSP40+) 在體內(nèi)腫瘤的富集。在 1 例肝內(nèi)膽管癌和 6 例 HCC 樣本中，我們發(fā)現(xiàn)了 TaNK 細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤浸潤(rùn)性 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞中的比例高于對(duì)應(yīng)的鄰近肝組織，這與我們的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)一致（圖 4E)。

然后，我們使用擬時(shí)序推斷分析來研究 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn) TaNK 細(xì)胞在 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞的推斷擬時(shí)間內(nèi)越來越多地出現(xiàn)，并且在終末期富集，與 RNA 速率分析的結(jié)果一致。為了檢驗(yàn) TaNK 細(xì)胞的新特征，我們將基因表達(dá)譜與擬時(shí)間擬合。有趣的是，CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞在過渡過程中表現(xiàn)出細(xì)胞毒性降低，抑制受體和應(yīng)激基因表達(dá)升高（圖 4F)。

值得注意的是，在所有腫瘤浸潤(rùn)的 CD56dimCD16hi NK 細(xì)胞亞群中，末端 TaNK 細(xì)胞具有最低的細(xì)胞毒性和最高的應(yīng)激評(píng)分。相比之下，相應(yīng)的 c7- NR4A3 在鄰近的非腫瘤組織中富集，具有高度的細(xì)胞毒性（圖 4G)。通過對(duì)幾種癌癥類型進(jìn)行多重免疫熒光染色，我們觀察到 TaNK 細(xì)胞表現(xiàn)出較低水平的 GZMB (圖 4H)。肝癌患者流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步證實(shí)，與 CD56dimCD16hi HSP40+ NK 細(xì)胞相比，TaNK 細(xì)胞腫瘤部位細(xì)胞毒性顆粒（顆粒酶 B 和穿孔素）表達(dá)較低，抑制受體 CD158a (KIR2DL1) 和 CD158e (KIR3DL1) 表達(dá)較高（圖 4I -J)。這些結(jié)果表明，TaNK 細(xì)胞可能與功能失調(diào)狀態(tài)有關(guān)。此外，我們還觀察到 NR4A 核受體家族隨著擬時(shí)間順序的增加而呈現(xiàn)的動(dòng)態(tài)差異趨勢(shì)（圖 4F)。c7-NR4A3 NK 細(xì)胞高表達(dá) NR4A2 和 NR4A3，而 TaNK 細(xì)胞高表達(dá) NR4A1。有趣的是，NR4A1 已被確定為 T 細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵介質(zhì)，并被認(rèn)為有助于限制實(shí)體瘤中 CAR - T 細(xì)胞的功能?？傊覀兊臄?shù)據(jù)表明，腫瘤中的 TaNK 細(xì)胞可能最終功能失調(diào)，并可能在 TME 中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

5. TaNK 細(xì)胞與不良預(yù)后和免疫治療耐藥的關(guān)系

由于 NK 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的表型和功能相似性，我們接下來研究了靶向 CD8+ T 細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB) 療法是否也會(huì)影響 NK 細(xì)胞。在腫瘤浸潤(rùn)性 NK 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞中，TaNK 細(xì)胞和耗竭 T 細(xì)胞（Tex) 表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激狀態(tài)（圖 5A)，提示它們參與腫瘤免疫應(yīng)答。均高度表達(dá)一系列抑制受體分子；然而，它們?cè)诟鞣N免疫調(diào)節(jié)基因上具有不同的表達(dá)譜。傳統(tǒng)的免疫檢查點(diǎn)基因如 PDCD1 和 CTLA4 在 TaNK 細(xì)胞上幾乎不表達(dá)（圖 5A)，這意味著它們不是抗 PD -1/CTLA- 4 治療的直接靶點(diǎn)。因此，在 TME 和當(dāng)前的 ICB 治療中，TaNK 細(xì)胞可能與 Tex 細(xì)胞發(fā)揮不同的作用。

我們觀察到不同癌癥類型的 TaNK 細(xì)胞豐度存在顯著差異（圖 5B)，腫瘤時(shí)期對(duì) TaNK 細(xì)胞比例的影響很?。▓D 5C)。值得注意的是，在癌癥基因組圖譜（TCGA) 數(shù)據(jù)集中，腫瘤中的高 TaNK 細(xì)胞信號(hào)與大多數(shù)癌癥類型的低生存率相關(guān)（圖 5D-E)。我們進(jìn)一步應(yīng)用基于深度學(xué)習(xí)的模型進(jìn)行反卷積和細(xì)胞組成分析，發(fā)現(xiàn)高 TaNK 細(xì)胞頻率表明癌癥患者預(yù)后不良。此外，我們通過分析先前乳腺癌和黑色素瘤的 ICB 治療研究中預(yù)處理腫瘤的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究了 TaNK 細(xì)胞是否與 ICB 治療應(yīng)答相關(guān)（圖 5F)。引人注目的是，在兩種癌癥類型中，無應(yīng)答患者中觀察到的 TaNK 細(xì)胞比例高于應(yīng)答患者。進(jìn)一步利用來自各種癌癥（包括黑色素瘤、肺癌、轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌）的已發(fā)表的大量數(shù)據(jù)，我們驗(yàn)證了無應(yīng)答患者比應(yīng)答患者表現(xiàn)出更強(qiáng)的 TaNK 細(xì)胞信號(hào)（圖 5G)。

我們推測(cè)，長(zhǎng)期浸潤(rùn)可能賦予腫瘤中 TaNK 細(xì)胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致其對(duì)惡性細(xì)胞的無效殺傷。TaNK 細(xì)胞的富集與對(duì)抗腫瘤的免疫反應(yīng)受損以及對(duì)當(dāng)前 ICB 治療的低敏感性有關(guān)。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了 TaNK 細(xì)胞在腫瘤中的潛在作用，并為 NK 細(xì)胞免疫療法的合理設(shè)計(jì)提供了參考。

7. 外周血 NK 細(xì)胞亞群的不同轉(zhuǎn)錄組模式

NK 細(xì)胞在血液中的淋巴細(xì)胞室中占相當(dāng)大的比例，但它們?cè)谀[瘤誘導(dǎo)的外周免疫系統(tǒng)中的作用相對(duì)不明確。我們的圖譜包含來自 35 名健康供者的血液來源 NK 細(xì)胞的 9 個(gè) scRNA 數(shù)據(jù)集，使我們能夠探測(cè)腫瘤患者外周血中 NK 細(xì)胞的特異性改變。

我們首先比較了來自健康供者的循環(huán) NK 細(xì)胞與來自腫瘤患者的循環(huán) NK 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，不同數(shù)據(jù)集的健康供者的循環(huán) NK 細(xì)胞顯示出高度相似性（圖 7B)。相比之下，對(duì)于來自腫瘤患者的循環(huán) CD56brightCD16lo 細(xì)胞，我們觀察到與健康供者的轉(zhuǎn)錄組存在顯著差異；在所分析的所有癌癥類型中，循環(huán) CD56dimCD16hi 細(xì)胞的差異甚至更為顯著（圖 7A)。值得注意的是，腫瘤患者在 NK 細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出顯著的組成變化，這種模式似乎是癌癥類型特異性的（圖 7C)。例如，在結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌和 HCC 中，循環(huán) CD56brightCD16lo c3-CCL3 NK 細(xì)胞的比例增加，但在其他被分析的癌癥類型中沒有增加。

接下來，我們將重點(diǎn)放在 CD56dimCD16hi c8-KLRC2 適應(yīng)性 NK 細(xì)胞上，該細(xì)胞在某些癌癥類型如結(jié)直腸癌和胃癌中富集（圖 7D)。適應(yīng)性 NK 細(xì)胞被認(rèn)為是 CAR NK 細(xì)胞的一個(gè)有吸引力的來源，因?yàn)樗鼈兙哂性鰪?qiáng)細(xì)胞因子反應(yīng)的效應(yīng)特性和對(duì)免疫抑制效應(yīng)的內(nèi)在抗性。特別有趣的是，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，與其他循環(huán) NK 細(xì)胞相比，這些細(xì)胞特異性表達(dá) MHC II 類基因（圖 7E)。我們還檢查了這些 NK 細(xì)胞在腫瘤患者中的功能變化，發(fā)現(xiàn)與健康供體相比，患者來源的適應(yīng)性 NK 細(xì)胞的功能基因和 MHC II 類基因的表達(dá)明顯更高（圖 7F, 7H)，這意味著它們?cè)谀[瘤患者中處于高度激活狀態(tài)。我們通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，與健康供者相比，HCC 患者循環(huán) NK 細(xì)胞中 MHC II 類分子的高表達(dá)（圖 7G)。因此，在患者源性適應(yīng)性 NK 細(xì)胞中上調(diào)的基因參與了免疫效應(yīng)過程的正調(diào)控等途徑（圖 7I)。綜上所述，我們的分析表明，循環(huán) NK 細(xì)胞參與了腫瘤進(jìn)展過程中外周免疫環(huán)境的系統(tǒng)性變化。

結(jié)論

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